Forschung

Fig: Colourized scanning electron micro-graph of Helicobacter pylori and human gastric epithelium cells. (Kindly provided by Dr. Volker Brinkmann, Max Planck Institute for Infectionbiology, Berlin)

Kleine regulatorische RNAs in den Humanpathogenen Helicobacter pylori und Campylobacter jejuni

Zusammenfassung:

Eine zentrale Kontrollebene von verschiedenen physiologischen Prozesse in der Zelle spielt die posttranskriptionelle Regulation der Genexpression. Neben regulatorischen RNAs spielen hierbei vor allem RNA-Bindeproteine eine wichtige Rolle, welche in Bakterien zusammen mit sRNAs als zentrale Regulatoren während der Anpassung an Stressbedingungen oder während der Pathogenität wirken. Unser Ziel ist es Helicobacter pylori, der Erreger von Magenkrebs, und Campylobacter jejuni, der derzeit häufigste bakterielle Durchfallerreger, als neue Modellorganismen für Riboregulation in pathogenen Bakterien zu etablieren. Hierbei sind wir insbesondere an der Identifizierung von kleinen regulatorischen RNAs und assozierten RNA-Bindeproteinen sowie deren Funktionen und Mechanismen in der Stressantwort und Virulenz dieser beiden Epsilonproteobakterien interessiert. Insbesondere benutzen wir hierbei sogenannte Hochdurchsatzsequenzierungen (RNA-seq) zur Transkriptomanalyse und Identifizierung neuer RNAs in Wirt und Pathogen.

Identifizierung kleiner RNAs und globale Analyse des Transkriptoms von Helicobacter pylori:

Bislang wurde angenommen, dass Epsilonproteobakterien, einschließlich wichtiger Pathogene wie H. pylori, keine regulatorischen RNAs besitzen, da ihnen ein weitverbreitetes RNA-Bindeprotein, Hfq, fehlt. Außerdem war bislang wenig über die Organisation und Struktur der Transkription des Genoms von H. pylori bekannt. Vor kurzem haben wir jedoch einen neuen,  differentiellen RNA-Sequenzierungsansatz (dRNA-seq) entwickelt, welcher auf Hochdurchsatz-sequenzierungstechnologie basiert, durch den wir ein unerwartet komplexes Transkriptions-muster, sowie massive antisense Transkription vom kleinen H. pylori Genom zeigen konnten. Außerdem erlaubte uns dieser Ansatz erstmals eine genomweite Kartierung von  Transkriptionsstartstellen, sowie die Definition der Operonstruktur in H. pylori. Weiterhin haben wir eine unerwartete Anzahl von ca.  60 sRNAs, einschließlich potenzieller Regulatoren von cis- und trans-kodierten Ziel-mRNAs, in H. pylori entdeckt (Sharma et al., 2010, Nature).

Laufende Forschungsprojekte:

Etwa 50% der Weltbevölkerung ist mit Helicobacter pylori, einem Gram-negativen Epsilonproteobakterium, infiziert. Durch seine Fähigkeit im sauren Milieu zu überleben kann es den Magen kolonisieren und dort Gastritis, Ulkus und auch Magenkrebs verursachen. Die Mechanismen der Genregulation von Helicobacter pylori sind weitgehend unbekannt. Unsere oben beschriebenen Transkriptomdaten des häufig untersuchten H. pylori Stammes 26695 stellen neben der Genomsequenz und den globalen Protein-Protein-Interaktionsdaten einen dritten Referenzdatensatz dar und deuten darauf hin, dass kleine RNAs und Antisensetranskription wichtige Mechanismen zur Genregulation in diesem Modellpathogen sind.

Viele der in unserer Transkriptomstudie neu identifizierten sRNAs sind potenzielle Kandidaten für trans-kodierte Antisense-RNAs. Zum Beispiel konnten wir mittels Proteom- und Transkriptomanalysen einer sRNA-Deletionsmutante einen Chemotaxisrezeptor als ein erstes Zielmolekül dieser sRNA identifizieren. Weiterhin haben wir nun mit der funktionalen Charakterisierung weiterer kleiner RNAs in diesem gentechnisch-veränderbaren Bakterium begonnen und sind insbesondere an einer Funktion der sRNAs in der bakteriellen Virulenz interessiert.  In diesem Zusammenhang forschen wir auch an der Identifizierung assoziierter RNA-Bindeproteine, sowie neuer Regulationsmechanismen durch kleine RNAs. Hierbei möchten wir insbesondere die Frage untersuchen, ob ein anderes RNA-Bindeprotein die Funktion von Hfq in übernimmt oder ob sRNAs in Epsilonproteobakterien über neue Mechnismen, unabhängig von einem RNA-Chaperon wirken. Die Forschung in H. pylori wird zudem auch Erkenntnisse in der Regulation durch sRNAs in verwandeten Epsilonproteobakterien bringen, einschließlich weitverbreiteter Pathogene wie z.B. Campylobacter und Arcobacter.

Campylobacter jejuni ist der derzeit häufigste bakterielle Durchfallerreger. Die Infektion erfolgt meist über kontaminierte Geflügel- oder Rohmilchprodukte und führt meist zu einer selbstlimitierenden Gastroenteritis, aber in einigen Fällen auch zu sekundären neurodegenerativen Autoimmunerkrankungen. Mittels einer vergleichenden dRNA-Seq Analyse verschiedener Campylobacter Isolate kartieren wir nun auch die Genstartpunkte in Campylobacter und haben erste sRNAs in C. jejuni entdeckt.

Ein weiterer Schwerpunkt unserer Forschung liegt in der Anwendung und Weiterentwicklung von Hochdurchsatzsequenzierungen in der Transkriptomanalyse von Pathogen-Wirts-Interaktionen. Mittels der vergleichenden dRNA-Seq Analyse von klinisch und evoluntionär relevanten Helicobacter und Campylobacter Stämmen können wir die Varianz der Transkription von (1) konservierten und (2) variablen, stammspezifischen Genen untersuchen und somit Gene definieren, welche in der Virulenz oder in bestimmten Stämmen eine Bedeutung haben. Außerdem werden NGS-basierte Methoden eine parallele Transkriptomanalysen von Wirt und Pathogen ermöglichen, da sie im Gegensatz zu Mikroarrays keine Kreuzhybridisierungsprobleme haben oder durch minimale RNA-Mengen limitiert sind.

Das ultimative Zeile unserer Forschung ist es, zum einen H. pylori und C. jejuni als neue Modellorganismen für RNA-Forschung in virulenten Bakterien und Bakterien ohne das RNA-Bindeprotein Hfq zu etablieren und zum anderen NGS-basierte Methoden auf ein breites Spektrum von Pro- und Eukaryonten sowie gemischten Wirt-Pathogen-Populationen anzuwenden.